常用抗體熒光染料的選擇

隨著免疫熒光技術(shù)的不斷發(fā)展，熒光染料及其標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物也被廣泛的應(yīng)用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。

目前，市場(chǎng)上抗體及蛋白標(biāo)記的熒光染料主要有CFTM系列(BIOTIUM, USA); Alexa Fluor? 系列(Life technology, USA); DyLight系列; Cy系列; IR Dye系列等等。使用多的為Alexa Fluor?系列和CFTM系列。

一、CFTM系列染料的核心對(duì)比Alexa Fluor?系列具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：

1、新型羅丹明核心

羅丹明染料以優(yōu)異的耐光性和良好的熒光量子產(chǎn)量著稱(chēng)。因此很多 Alexa Fluor? 染料具有羅丹明核心結(jié)構(gòu)，但是，傳統(tǒng)羅丹明的化學(xué)結(jié)構(gòu)很難從長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光染料延伸遠(yuǎn)紅外區(qū)域甚是更具挑戰(zhàn)性的近紅外區(qū)域，而且生物偶聯(lián)后其水溶性并不理想。 Biotium 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)從綠色到近紅外多色熒光的羅丹明染料的新型化學(xué)方法。該方法被有效的應(yīng)用于CF染料的產(chǎn)品中，尤其是遠(yuǎn)紅外CF染料，而且通過(guò)這種方法制備的染料不僅水溶性而且耐光性*。

2、特異性高的近紅外染料

近紅外染料大的特點(diǎn)是比可見(jiàn)光范圍要大很多，大滴的染料常會(huì)導(dǎo)致染料水溶性低、染料聚合體多、熒光量子產(chǎn)量差等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題，許多商用的近紅外染料比如 AlexaFluor? 、 DyLight?dyes 和IRDyes? 近紅外染料，在制備時(shí)吸附了大量的帶負(fù)電荷的磺化基團(tuán)，其磺化作用可以在一定程度上會(huì)提高染料的溶解性和熒光性，但這樣也帶來(lái)了另一些更加嚴(yán)重的問(wèn)題，經(jīng)這種染料標(biāo)記的生物耦聯(lián)物的非特異性結(jié)合。Biotium 的科學(xué)家用革命性的方法設(shè)計(jì)出近紅外染料CF，在避免引入大量負(fù)電荷的情況下，極大的保證了染料優(yōu)異的理化特性。Biotium 近紅外的CF 染料以花青或羅丹明染料為核心結(jié)構(gòu)，該核心結(jié)構(gòu)的特殊化學(xué)修飾限制了染料的分子內(nèi)位移，從而獲得染料的高量子產(chǎn)率和更好的水溶性。因此，近紅外CF染料比其他近紅外染料熒光強(qiáng)度更高，光穩(wěn)定性好。重要的是，在免疫印跡實(shí)驗(yàn)上應(yīng)用近紅外CF染料標(biāo)記蛋白質(zhì)樣品相對(duì)于其他商業(yè)用近紅外染料制備的抗體偶聯(lián)物，大限度的提高了信噪比。

3、優(yōu)異的標(biāo)記效率

生物偶聯(lián)后的活性染料一般很容易水解，會(huì)在運(yùn)輸，操作及儲(chǔ)存中帶來(lái)諸多不便，終致染料結(jié)合效率低下。像Alexa Fluor?dyes ，DyLight?dyes and IRDyes? 等嚴(yán)重的磺化作用有較強(qiáng)的吸濕性，惡化水解作用等問(wèn)題。所有Biotium的CF染料具有相對(duì)穩(wěn)定的胺活性的SE基團(tuán)型，這比大部分AlexaFluor 染料的SE更耐水解。總體來(lái)說(shuō)，CF染料SE產(chǎn)品一貫的給出更高的標(biāo)記效率，提供給用戶更好的使用價(jià)值。

二、選擇方案：

1、藍(lán)色（350-450nm處激發(fā)）

CF 350、Alexa Fluor 350、AMCA等——亮藍(lán)和紫外光激發(fā)；

CF350是類(lèi)似于 Alexa Fluor 350 和傳統(tǒng)熒光染料AMCA的藍(lán)色熒光染料，CF350的熒光強(qiáng)度高于 Alexa Fluor350、AMCA ,吸附在蛋白上的熒光超過(guò)50%, 水溶性更好, 耐光性非常亮, 更容易與現(xiàn)有的綠色熒光基團(tuán)區(qū)分；

CF 405S/ CF 405 M、Alexa Fluor 405 ----近乎的匹配藍(lán)色二極管激光器；

CF 405S/ CF 405 M 、Alexa Fluor 405與近來(lái)使用的熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀405nm;譜線的藍(lán)色二極管激光器的匹配。在流式細(xì)胞儀上的分析結(jié)果顯示CF 405S/ CF 405 M熒光信號(hào)強(qiáng)度高于Alexa Fluor 405染料1.7倍。

2、綠色（488nm處激發(fā)）

CF 488A、Alexa Fluor 488、FITC、FAM、DyLight 488、Cy2等----針對(duì)488nm 氬離子激光器的綠色熒光染料；

以上染料其標(biāo)記的抗體蛋白適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀；流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測(cè)；或者可用于熒光顯微鏡技術(shù)；

CF 488A低限度的帶電量降低了與抗體耦聯(lián)物的非特異性結(jié)合；在紅色通道溢出少于Alexa Fluor 488；耐光性好；水溶性好和pH 不敏感；良好的穩(wěn)定性和活性染料的標(biāo)記率。

Alexa Fluor 488在較寬的PH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定（PH4~10）；

FITC激發(fā)波長(zhǎng)488nm，大發(fā)射波長(zhǎng)525nm；缺點(diǎn)熒光強(qiáng)度易受PH值影響，PH值降低時(shí)其熒光強(qiáng)度減弱。

3、橙紅色（543-555nm處激發(fā)）

CF 543、Alexa Fluor 546、ATTO550、Cy 3、DyLight 549、Rhodamine (TRITC) 匹配543nm的橙色熒光染料；

CF ?543 熒光條帶明亮，耐光，水溶性好，確保了CF 543染料與抗體的耦聯(lián)物保持優(yōu)異的水溶性，為該波段亮的橙色熒光染料。例如：同等的標(biāo)記程度下，CF 543標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體的亮度高于用Alexa Fluor 546 標(biāo)記的2~10倍。

CF 555、Alexa Fluor 555、Tetramethylrhodamine (TAMRA) 等匹配Cy3濾光片的橙色熒光染料；

4、紅色（568-594nm處激發(fā)）

CF 568、Alexa Fluor? 568、ATTO 565、Rhodamine Red等568nm處紅色熒光染料；

CF 568染料耐光性好；水溶性；比Alexa Fluor 568 標(biāo)記的抗體亮度更亮；

CF 594、Alexa Fluor? 594、ATTO? 594、DyLight? 594、Texas Red 等亮紅色熒光染料；

CF594由于其高量子產(chǎn)量和優(yōu)異的水溶性而比AlexaFluor594 明亮2~4倍。同時(shí)CF594 對(duì)光極其穩(wěn)定，使它能被理想地應(yīng)用于諸如共聚焦顯微鏡和單分子顯像條件苛刻的應(yīng)用中去。

5、遠(yuǎn)紅外（620-660nm處激發(fā)）

CF 620R、LightCycler Red 640等620nm處；

CF 620R是以紅色熒光染料羅若丹（rhodamine）為基礎(chǔ)的遠(yuǎn)紅外的熒光染料，該染料有高熒光亮度和極度的耐光性。它的吸收和發(fā)射光譜為617 和639nm，該染料能被用于熒光能量共振轉(zhuǎn)移中高能量的接收者，或者在激發(fā)和發(fā)射窗口能和該染料的光譜特性匹配的條件下，被應(yīng)用于多色檢測(cè)中的高熒光量采集。染料的的水溶性有利于生物耦合在水介質(zhì)中，更好的保持耦聯(lián)物的生物特異性結(jié)合。

CF 633、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Cy 5、DyLight 633、DyLight 649等633/635nm 激光線的佳染料熒光染料；

CF 633染料的優(yōu)點(diǎn)：當(dāng)被633nm 氦氖激光或635nm 紅色二極管激光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生亮的抗體耦聯(lián)物；光穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于AlexaFluor 647；的水溶性；

CF 640、Alexa Fluor 647、ATTO 647N、Cy 5、DyLight 649等遠(yuǎn)紅外熒光染料；

CF 640R 的優(yōu)點(diǎn)：以紅色染料羅丹明（rhodamine）為基礎(chǔ)，吸收和發(fā)射峰類(lèi)似Cy5、Alexa Fluor647；但以羅丹明（rhodamine）為基礎(chǔ)的紅色染料CF 640R它大的優(yōu)點(diǎn)就是對(duì)光穩(wěn)定性，Cy5 和 Alexa Fluor 647以花青素為基礎(chǔ)，因此有著和花青素一樣的特點(diǎn)即耐光性較差。*的亮度和耐光性使CF 640R 被理想的用于共聚焦顯微鏡和單分子成像等條件苛刻的檢測(cè)中。

CF 647、Alexa Fluor 647、ATTO 647N、DyLight649等遠(yuǎn)紅外熒光染料；

以花青素為基礎(chǔ)的遠(yuǎn)紅外熒光染料CF 647 比Cy 5、Alexa Fluor 647 明亮。

CF 660、Alexa Fluor? 660、Allophycocyanin (APC)等介于遠(yuǎn)紅外近紅外之間的熒光染料；

6、近紅外（680-790nm處激發(fā)）

CF 680R/680、Alexa Fluor 680、Cy 5.5、IR Dye 680等近紅外熒光染料；

CF 680 是高水溶性的以花青素為基礎(chǔ)的染料，分子量大約為3000。該染料標(biāo)記抗體，發(fā)出亮的熒光和在免疫染色光譜相似的染料中產(chǎn)生高的信噪比。

CF 680R 分子量約為900，更適合標(biāo)記核酸或者相對(duì)小的生物分子。

CF 680R 是新型的以羅丹明（rhodamine）為基礎(chǔ)的高熒光亮度, 極度耐光性染料，這使它可被理想地用于共聚焦顯微鏡，單分子成像等條件要求苛刻的應(yīng)用中。

CF 750、CF 770 和 CF 790等近紅外熒光染料；

CF 750、CF 770、CF 790是領(lǐng)域內(nèi)真正具有突破性的長(zhǎng)波長(zhǎng)的新型染料代表。其他近紅外染由于受到染料聚集和穩(wěn)定性差等因素的影響而導(dǎo)致熒光亮度有限。基于Biotium科學(xué)家研制的新型分子工程技術(shù)，近紅外CF 染料克服了這些問(wèn)題。即使在633 nm 被激發(fā)，CF750 也會(huì)比APC-AlexaFluor 750擁有足夠的亮度來(lái)在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中帶來(lái)更好的信噪比，而且不存在串聯(lián)染料的低穩(wěn)定性等問(wèn)題。另外，近紅外CF 染料高度水溶性，沒(méi)有會(huì)增加抗體耦聯(lián)物非特異性結(jié)合的過(guò)剩的負(fù)電荷，也代表了該產(chǎn)品的性能。