1. D-PFH-vPC具有良好的載藥穩(wěn)定性和超聲成像增強(qiáng)能力

利用四種常用的PFCs（PFP、PFH、PFOB和PFCE）制備了四種D-vPCs；同時(shí)，D-VPL是利用正常磷脂代替硅質(zhì)體制備的。通過(guò)冷凍蝕刻掃描電子顯微鏡對(duì)四種D-VPC的形態(tài)進(jìn)行了表征（圖1a），發(fā)現(xiàn)所有D-VPC均為球形，直徑相對(duì)均勻。對(duì)納米液滴的理化特性進(jìn)行分析（圖1b-h），結(jié)果顯示：研究發(fā)現(xiàn)D-PFP-vPCs缺乏形態(tài)穩(wěn)定性和載藥穩(wěn)定性；而D-PFOB-vPCs和D-PFCE-vPCs的DOX包封效率低、對(duì)M-HIFU觸發(fā)的DOX釋放反應(yīng)速度慢、缺乏增強(qiáng)超聲成像的能力。D-PFH-vPCs同時(shí)具有良好的穩(wěn)定性和增強(qiáng)超聲成像的能力。

2. vPCs-O₂+M-HIFU可以有效緩解體外缺氧介導(dǎo)的MDR和EMT

作者首先檢測(cè)vPCs的主動(dòng)腫瘤靶向能力，在溫和的酸性環(huán)境中用vPCs孵育細(xì)胞后的平均熒光強(qiáng)度是中性環(huán)境（pH7.2-7.4）中的2.5倍，顯示了var7靶向酸性腫瘤環(huán)境的能力（圖2a）。然后，檢測(cè)了載氧vPCs對(duì)腫瘤缺氧狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示：vPCs-O₂+M-HIFU與細(xì)胞共孵育后，缺氧的4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為較低的缺氧狀態(tài)（圖2b）；MDR相關(guān)基因如MDR1、HIF-1α和P-gp的表達(dá)量顯著降低（圖2c、d和e）。當(dāng)用D-vPCs-O₂+M-HIFU處理細(xì)胞時(shí)，與D-vPCs-N₂+M-HIFU相比，DOX攝取增加了103.8%，細(xì)胞活力顯著降低62.5％，細(xì)胞凋亡活性顯著增加111.3％（圖2f-h）。綜上所述，D-vPCs-O₂+M-HIFU超聲可以緩解腫瘤細(xì)胞缺氧狀態(tài)，下調(diào)MDR相關(guān)基因和蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)DOX積累。

進(jìn)一步研究了D-vPCs-O₂+M-HIFU對(duì)EMT的影響。經(jīng)vPCs-O₂+M-HIFU處理后，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量分別顯著減少70.8%和65.4%（圖2i、j）。在D-vPCs-O₂+M-HIFU處理后，與D-vPCs-N₂+M-HIFU相比，遷移細(xì)胞和侵襲細(xì)胞的數(shù)量分別顯著減少了67.0%和71.6%。ELISA定量EMT標(biāo)記物的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2k所示，vPCs-O₂+M-HIFU顯著下調(diào)缺氧細(xì)胞TGF-β1和EMT標(biāo)記物如鈣粘蛋白E、Vimentin和Twist的表達(dá)水平，而低濃度DOX顯著上調(diào)其表達(dá)水平。D-vPCs-O₂+M-HIFU進(jìn)一步下調(diào)已經(jīng)上調(diào)的TGF-β1和EMT標(biāo)記物。這表明vPCs-O₂+M-HIFU可有效抑制腫瘤細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化。

3. 體內(nèi)熒光成像、生物分布和M-HIFU介導(dǎo)的藥物釋放研究

由于DOX不適用于活體成像，制備了Cy7-vPCs、Cy7-vPLs和Cy7-Doxil。靜脈注射給單層4T1荷瘤BALB/c小鼠，體內(nèi)熒光成像結(jié)果顯示：Cy7-vPCs+M-HIFU的腫瘤熒光強(qiáng)度曲線下面積（AUC_0-72h）比Cy7-vPCs的升高4.6倍（圖3a和b）；Cy7-vPCs+HIFU的AUC_0-72h比Cy7-PCs+HIFU的高1.7倍（圖3a，b）。中和的腫瘤AUC_0-72h明顯低于未處理的腫瘤，進(jìn)一步顯示了var7靶向酸性腫瘤微環(huán)境的能力。

采用雙側(cè)異種移植瘤評(píng)估Cy7-vPCs和D-vPCs的M-HIFU反應(yīng)性。如圖3c所示，靜脈注射后，僅用M-HIFU超聲處理腫瘤的一側(cè)。MDA-MB-231荷瘤BALB/c裸鼠（圖3d）或4T1荷瘤鼠（圖3e）注射游離Cy7、Cy7-vPCs或Cy7-Doxil。注射Cy7-vPCs后，經(jīng)M-HIFU超聲處理的一側(cè)腫瘤的熒光明顯高于未經(jīng)超聲處理的另一側(cè)腫瘤。DOX（或Cy7）的生物分布顯示：D-vPCs+M-HIFU處理后，明顯增加了在腫瘤中的DOX累積；顯著降低了心臟中的DOX蓄積（圖3g-h）。

4. D-vPCs+M-HIFU可以有效緩解體內(nèi)腫瘤缺氧，實(shí)現(xiàn)超聲成像引導(dǎo)化療

在4T1荷瘤小鼠體內(nèi)檢測(cè)vPCs緩解腫瘤缺氧的效果，評(píng)估化療的有效性。結(jié)果顯示，M-HIFU超聲聯(lián)合高氧呼吸使腫瘤缺氧區(qū)域面積減小（圖4a），降低了HIF-1α和P-gp的相對(duì)表達(dá)水平（圖4b）。D-vPCs-O₂表現(xiàn)出較強(qiáng)的超聲（US）成像，并最終在整個(gè)腫瘤區(qū)域?qū)崿F(xiàn)高頻信號(hào)擴(kuò)散（圖4c）。這個(gè)過(guò)程伴隨著氧和DOX的釋放。因此，M-HIFU響應(yīng)性超聲成像顯示出監(jiān)測(cè)D-vPC中氧和DOX釋放的潛力，從而實(shí)現(xiàn)超聲成像引導(dǎo)化療。與其他實(shí)驗(yàn)組相比，D-vPCs+M-HIFU表現(xiàn)出更好的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用（P<0.05），腫瘤生長(zhǎng)抑制率高達(dá)94.6%，實(shí)現(xiàn)了最高比例的凋亡（> 90%），并且腫瘤核被廣泛破碎（圖4d-g）。

同時(shí)，進(jìn)一步詳細(xì)研究了心臟損傷和骨髓抑制，因?yàn)樗鼈兪荄OX的主要副作用。結(jié)果顯示：與其他實(shí)驗(yàn)組相比，D-vPCs-O₂+M-HIFU處理后，DOX在心臟組織中的積累顯著減少，DOX誘導(dǎo)心臟細(xì)胞的凋亡比例顯著降低（圖5a）。D-vPCs-O₂+M-HIFU組的肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、白細(xì)胞（WBC）無(wú)明顯變化（圖5b-d），表明D-vPCs-O₂+M-HIFU副作用極小，不會(huì)造成嚴(yán)重的心臟損傷和骨髓抑制。

5. vPCs-O₂+M-HIFU有效緩解EMT和抑制肺轉(zhuǎn)移

通過(guò)小鼠活體成像檢查體內(nèi)化療后肺癌移植瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示：PBS組小鼠均有自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移（圖6a）。相較于PBS組，vPCs-O₂+M-HIFU組小鼠轉(zhuǎn)移至肺表面的癌細(xì)胞數(shù)量和面積顯著減少（圖6b-c）。比較腫瘤EMT標(biāo)記物EMT相關(guān)基因表達(dá)量的變化（圖6d-h），表明vPCs-O₂+M-HIFU能顯著緩解EMT。與D-vPCs+M-HIFU相比，D-vPCs-O₂+M-HIFU不僅緩解了腫瘤缺氧，而且降低了缺氧介導(dǎo)的MDR，而增強(qiáng)化療在緩解EMT方面也可能具有協(xié)同作用。

6. D-vPCs-O₂+M-HIFU可以減少熱療消融后的腫瘤復(fù)發(fā)

探究新輔助化療與熱療聯(lián)合治療的合理性，體外研究結(jié)果顯示：化療-熱療聯(lián)合治療的抗癌效果均明顯優(yōu)于單獨(dú)化療或單獨(dú)熱療（圖7a）；同時(shí)，不管DOX濃度如何，協(xié)同作用依然明顯存在（圖7b）。在4T1荷瘤裸鼠中進(jìn)一步進(jìn)行聯(lián)合治療，發(fā)現(xiàn)PBS處理組經(jīng)熱療消融后，所有腫瘤均快速?gòu)?fù)發(fā)（圖 7cI，dI）。

游離DOX或Doxil處理組經(jīng)熱療消融后，復(fù)發(fā)腫瘤的百分比分別下降至 66.7% 和 50.0%（圖7dII，III）。D-vPCs-O₂+M-HIFU處理組的抗腫瘤作用更強(qiáng)，在熱療后60天內(nèi)未觀察到腫瘤復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移（圖7cⅣ，dⅣ）D-vPCs-O₂+M-HIFU的兩次給藥明顯降低了HSP-27和HSP-90的表達(dá)水平（圖7e），表明體內(nèi)也存在協(xié)同效應(yīng)。因此，D-vPCs-O₂+M-HIFU適合作為新型輔助化療藥物，從而減少熱療消融后的腫瘤復(fù)發(fā)。