2.TNF-α增加ATDC5細(xì)胞中GPR17的表達(dá)

接下來，作者測(cè)定了TNF-α對(duì)ARDC5細(xì)胞中GPR17表達(dá)的影響。圖2A中的結(jié)果顯示，與基線相比，三種劑量的TNF-α將GPR17的mRNA水平分別增加到1.7倍、2.3倍和2.8倍。圖2B顯示，經(jīng)TNF-α處理后，GPR17的蛋白質(zhì)水平升高到1.6倍、2.1倍和2.5倍。總的來說，TNF-α在基因和蛋白質(zhì)水平上都表現(xiàn)出很強(qiáng)的促進(jìn)GPR17表達(dá)的能力。

3.普侖司特可降低TNF-α誘導(dǎo)的ATDC5細(xì)胞氧化應(yīng)激

普侖司特的分子結(jié)構(gòu)如圖3A所示。為了確定普侖司特對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響，作者測(cè)定了ROS和SOD的水平。如圖3B所示，TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加了3.3倍，用5μM和10μM普侖司特處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平僅增加到2.4倍和1.6倍。同時(shí)，TNF-α將SOD活性降至15.6U/100mg蛋白質(zhì)，而基線時(shí)為31.1U/100mg蛋白質(zhì)。然而，5μM普侖司特將SOD活性提高到23.4U/100mg蛋白質(zhì)，10μM普侖司特進(jìn)一步將其提高到29.8U/100mg蛋白質(zhì)（圖3C），接近基線水平。普侖司特表現(xiàn)出劑量依賴性的抗氧化作用。

4.普侖司特抑制TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原減少

抑制細(xì)胞中II型膠原降解是預(yù)防和治療OA的普遍靶點(diǎn)。這篇研究中，作者試圖確定普侖司特對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原減少的影響。Col2a1的mRNA水平在單獨(dú)暴露于TNF-α時(shí)降低到45%，而用5μM和10μM普侖司特處理時(shí)，Col2a1的mRNA水平分別上升到68%和92%，結(jié)果如圖4A所示。圖4B顯示，與上述相同劑量的普侖司特可使Ⅱ型膠原的蛋白質(zhì)含量提高到71%和94%，而TNF-α處理組的Ⅱ型膠原的蛋白質(zhì)含量為51%。

5.GPR17的敲除在基因和蛋白水平上都阻止了TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原減少

普侖司特作為GPR17的*拮抗劑，其對(duì)ATDC5細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過阻斷GPR17的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。為了驗(yàn)證這一理論，作者使用siRNA沉默GPR17的表達(dá)（圖5A）。圖5B和5C的結(jié)果顯示，GPR17的敲除對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的Col2a1基因和II型膠原蛋白的減少具有保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)表明GPR17的表達(dá)介導(dǎo)II型膠原的減少。

在補(bǔ)充材料中，作者檢測(cè)了普侖司特對(duì)GPR17表達(dá)的影響。結(jié)果表明，普侖司特在基礎(chǔ)條件下和TNF-α處理下均降低了GPR17在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá)。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)GPR17的過表達(dá)消除了普侖司特對(duì)Col2a1基因表達(dá)和II型膠原蛋白表達(dá)的保護(hù)作用。這些研究結(jié)果表明，普侖司特對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原減少中的有益作用是通過抑制GPR17介導(dǎo)的。

6.普侖司特在ATDC5細(xì)胞中可恢復(fù)TNF-ɑ誘導(dǎo)的SOX-9的減少

SOX-9是一種在軟骨形成中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。SOX-9的表達(dá)對(duì)抑制TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原降解具有重要作用。如圖6A中所示，TNF-α誘導(dǎo)SOX-9的mRNA水平降低52%，分別用5μM和10μM普侖司特處理后可增加到73%和95%。與單獨(dú)TNF-α處理組相比（55%），與上述相同劑量的普侖司特將SOX-9的蛋白質(zhì)水平分別提高到76%和97%（圖6B）。

7.普侖司特在ATDC5細(xì)胞中可降低TNF-ɑ誘導(dǎo)的MMP-3和MMP-13的表達(dá)

由于MMP-3和MMP-13被認(rèn)為是參與II型膠原降解的重要的酶，因此作者確定了普侖司特對(duì)這兩種蛋白表達(dá)的影響。圖7A顯示，TNF-α刺激后，MMP-3和MMP-13的mRNA水平分別增加了3.2倍和3.9倍。然而，5μM的普侖司特將MMP-3和MMP-13 mRNA水平分別降低到2.1倍和2.3倍，10μM的普侖司特將MMP-3和MMP-13 mRNA水平分別降低到1.5倍和1.7倍。與之一致的是，圖7B的結(jié)果顯示，經(jīng)TNF-α處理后，MMP-3和MMP-13的蛋白水平上升至342.3pg/mL和645.3pg/mL，高于基線時(shí)的89.5pg/mL和139.2pg/mL。同時(shí)，5和10μM普侖司特將MMP-3的蛋白水平分別降低到265.7和185.6pg/mL，MMP-13的蛋白水平分別降低到466.9和327.5pg/mL。

8.普侖司特在ATDC5細(xì)胞中可抑制TNF-ɑ誘導(dǎo)的IRF-1的表達(dá)

MMP-3和MMP-13受IRF-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在這里，作者測(cè)定了普侖司特對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的IRF-1表達(dá)的影響。圖8A的結(jié)果顯示，TNF-α誘導(dǎo)IRF-1在基因水平上的表達(dá)增加了3.2倍，而用5μM和10μM普侖司特處理后，IRF-1的表達(dá)分別下降到2.1和1.4倍。如預(yù)期一致，圖8B所示，兩劑量的普侖司特分別將IRF-1的蛋白水平降低到1.9倍和1.5倍，相比之下，單獨(dú)使用TNF-α處理的IRF-1蛋白水平為2.9倍。后，圖8C的免疫染色結(jié)果顯示，單獨(dú)TNF-α處理后，IRF-1的表達(dá)明顯增加到3.2倍。然而，5μM普侖司特可使IRF-1水平降低到2.2倍，10μM普侖司特可使IRF-1水平進(jìn)一步降低到1.6倍。

9.普侖司特抑制TNF-α誘導(dǎo)的JAK2/STAT1通路的激活

JAK2/STAT1通路已被證明在OA中調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和MMPs的產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這項(xiàng)研究中，作者確定了普侖司特阻斷GPR17是否會(huì)抑制JAK2/STAT1通路的激活。如圖9所示，Western Blot分析顯示，與基線相比，TNF-α處理顯著提高了p-JAK2和p-STAT1的水平，約為2.7倍和2.9倍。而5μM普侖司特抑制p-JAK2和p-STAT1的表達(dá)，分別為2.1倍和1.9倍。此外，10μM普侖司特進(jìn)一步將這些值降低到1.5和1.4倍。普侖司特對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的JAK2/STAT1通路的激活具有較強(qiáng)的抑制作用。

綜上所述，作者的研究提供了新的證據(jù)，表明普侖司特通過阻斷GPR17的表達(dá)，對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原降解具有保護(hù)作用。作者的發(fā)現(xiàn)提示GPR17可能是治療OA的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。然而，還需要更多的試驗(yàn)來進(jìn)一步研究GPR17及其拮抗劑對(duì)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展和發(fā)展的影響。